C'est en répondant à une annonce de Pupi Avati, parue dans Il Resto del Carlino, que Stefano Accorsi commence sa carrière d'acteur. Le réalisateur lui confie un petit rôle dans le film Frères et sœurs et, peu après, Stefano entre dans la "Compagnia del Teatro Stabile" de Bologne. La reconnaissance arrive grâce à une série de spots télévisés et se consolide en 1996 avec le film Jack Frusciante è uscito dal gruppo. Il est dirigé, entre autres, par les réalisateurs Enza Negroni, Carlo Mazzacurati, Daniele Luchetti.
En 1999, il remporte un David di Donatello pour Radiofreccia, premier film de Luciano Ligabue. L'an 2000 se révèle être une année particulièrement chargée : il tourne avec Ferzan Ozpetek dans Tableau de famille, avec Gabriele Muccino dans Juste un baiser, avec Nanni Moretti dans La chambre du fils.
En 2001 il joue dans Santa Maradona, sous la direction de Marco Ponti, et dans Un viaggio chiamato amore de Michele Placido. Pour ce dernier film, il reçoit la "Coppa Volpi" du meilleur acteur au :cinema:Festival de Venise. Il travaille à nouveau avec Michele Placido dans Ovunque sei et Romanzo criminale ; avec Carlo Mazzacurati dans Romance italienne. Très apprécié en France, Stefano Accorsi a également tourné avec Jérôme Cornuau, Julie Gavras et Daniel Cohen. Pour le petit écran, il a interprété Come quando fuori piove et Le jeune Casanova.
